Биосенсоры это устройства, включающие биогенный распознающий элемент. Эта распознающая часть может состоять из клеток, антител, ДНК, РНК, ферментов и рецепторов. Биологический процесс трансформируется биосенсром в электрический или оптический сигнал, который можно принять и интерпретировать. Часто распознающем элементом являются белки, но их не всегда легко получить, и для работы их могут понадобится особые условия или кофакторы. Поэтому иногда проще отказаться от получения очищенных молекул и использовать в качестве чувствительного элемента целые клетки, например бактерии или дрожжи.
Такие микроорганизмы-биосенсоры гораздо более стабильны и менее требовательны к условиям хранения, чем очищенные белки. Их получение требует меньших затрат, поскольку они не требуют сложных процедур очистки. Кроме того, они, как полноценные биологические системы, содержат сами по себе необходимые кофакторы, и их внутренняя среда - естественная для протекания биохимических превращений. Микроорганизмы используются в составе биосенсорных систем для решения различных задач, в частности – для выявления загрязнителей в окружающей среде.
Биодоступность - способность соединения взаимодействовать с живыми организмами нефизическим путём, адсорбироваться клетками и тканями организма. Она характеризует не только опасность загрязнителя, но и возможность его биоремедиации. Например, тяжёлые металлы в почве или на дне водоёмов часто становятся биодоступными только переходя в раствор. Однако и в растворённом виде, и в виде частиц тяжёлые металл, если верить биосенсорам, не является биодоступным на все 100%. Как правило, биодоступны 50 – 0,1% содержащегося в образце металла. С помощью биосенсоров можно оценить соотношение вещества в биодоступной форме и сравнить этот показатель с общей концентрацией, установленной химическими методами.
В основе работы биосенсора, как правило, лежат сигнальные и метаболические пути, которые уже существуют в природе. Однако, чтобы использовать эти возможности было проще, как правило, гены, кодирующие соответствующие продукты переносят в клетки кишечных палочек, или других устойчивых и простых в обращении микроорганизмов. Сигнал биосенсора может иметь различную природу. Это и изменение pH среды, то есть электрохимический сигнал, который можно определить электродами, и различные виды оптических сигналов – изменение цвета за счёт формирования цветного продукта, накопление флюоресцентных продуктов или биолюминесценция. Например, регулятор роста растений α-нафталин уксусной кислоты и пестицид линдан разрушаются с образованием кислоты.
Иммобилизация микроорганизмов, способных осуществлять ткие процессы на электроде позволяет создать электрохимический сенсор. Гидролиз фосфорорганического пестицида параоксона идёт с образованием жёлтого p-нитрофенола, и этот процесс можно детектировать по изменению цвета. Однако в ряде случаев не удаётся найти адекватную реакцию, которая могла бы дать легко детектируемый продукт или существенное изменение характеристик среды. В таких случаях применяются гены, продукты которых, репортерные белки, катализируют реакции, детектируемые по изменению цвета или люминесценции, или способны к флюоресценции. β-галактозидаза, например, может взаимодействовать с различными субстратами, образуя окрашенные, люминесцентные и электрохимические продукты. Множество описанных флюоресцентных белков, а также люциферазы и их субстраты, люциферины, которые превращают энергию гидролиза АТФ в люминесцентный сигнал, могут быть источником свечения, которое будет ответом биосенсора на стимул.
Одним из наиболее распространённых вариантов механизма работы микроорганизма-биосенсора, является пара «транскрипционный регулятор – промотор». Под промотор помещается ген того или иного репортерного белка и детектируется его синтез в ответ на сигнал. Такие сенсоры могут выявлять мишени, вызывающие ответ у микроорганизмов – наличие тяжёлых металлов, антибиотиков или токсинов в окружающей среде.
Как правило, для биосенсоров, действие которых основано на активации промотора в ответ на присутствие тяжёлых металлов, используются уже существующие промоторные последовательности. Это промоторы генов, продукты которых защищают микроорганизмы от воздействия тяжёлых металлов. Такие системы могут обеспечивать устойчивость к свинцу, ртути, кадмию, мышьяку, серебру, сурьме, токсичным даже в малой концентрации, и к металлам, которые опасны только в повышенных концентрациях – цинку, железу, никелю, меди, кобальту и хрому. Некоторые системы очень специфичны: гены isiAB Synechococcus sp, copBC Pseudomonas fluorescens и pbrR и chrA Cupriavidus metallidurans отвечают только на присутствие железа, меди, свинца и хрома соответственно.
У Escherichia coli, напротив, arsR отвечает на присутствие мышьяка, кадмия и сурьмы, cadC активируется кадмием, свинцом, сурьмой, цинком и оловом, а zntA - кадмием, хромом, ртутью, свинцом и цинком. Во всех вышеуказанных случаях активируются системы защиты, однако описана цианобактерия, у которой в ответ на присутствие некоторых потенциально опасных металлов активируются системы, обеспечивающие поступление необходимых ей металлов в клетку. Такая система была бы более чувствительной к низким концентрациям. Пара регулятор-промотор XylR и Pu, найденная в пути деградации ксилола Pseudomonas sp и может применяться для выявления ксилола, бензола и толуола, а пара DmpR и Po аналогичным образом может использоваться в биодетекторе фенолов.
Однако есть и другие механизмы работы биосенсоров. Чувство кворума управляется низкомолекулярными соединениями, которые распространяются на несколько микрон вокруг клетки, например ацил-гомосеринлактонами. Под контролем систем чувства кворума находятся продукция факторов вирулентности, формирование биоплёнок, биолюминесценция, состояние компетентности, споруляция и другие процессы. Когда E.coli, продуцирующая GFP в осциллирующих количествах, была выращена в микрофлюидных каналах под контролем системы чувства кворума, которая, в свою очередь, была помещена под промотор, активируемый в присутствии мышьяка, в присутствии мышьяка осцилляция флюоресценции учащалась.
Белки можно «заставить» присутствовать на поверхности клетки, присоединяя к генам последовательности, кодирующие сигнальные структуры, которые определят направление транспорта продукта. Инсектицид паратион и параксон будут разлагаться культурой бактерий в семь раз эффективнее, если фермент находится на поверхности клетки. Если разместить такие микроорганизми в системе, детектирующей электрохимические процессы, можно использовать их в качестве компонента биосенсора, и выявлять таким путём фосфорорганические пестициды.
Рецепторы, сопряжённые с G-белком – большое семейство мембранных рецепторов. Они взаимодействуют как низкомолекулярными соединениями, так и с белками и гликопротеинами. Сигнал от этих рецепторов передаётся к GTP-связывающим белкам (G-белкам) и активирует клеточный ответ. GPCR человека, связывающиеся с опиоидами, нейротрансмиттерами, гормонами и нуклеотидами могут успешно экспрессироваться и работать в дрожжах. Искусственно полученные мутантные формы могут повышать чувствительность системы в десятки раз. Активация ионных каналов, ведущая к изменению мембранного потенциала в ответ на присутствие лиганда – вариант для выявления ионов и молекул.
Такие биосенсоры могут позволить получить ответ в короткие сроки – не более нескольких часов, в том числе и вне лаборатории, за счёт устойчивости микроорганизмов и их нетребовательности к условиям хранения и перевозки. Получение мутантных рецепторов, повышающих чувствительность систем, создание новых генно-инженерных конструкций, которые позволят отвечать на сигнал точнее, поиск и использование существующих в природе рецепторов и регуляторов – всё это пути создания более быстрых и точных сенсоров. Такие биосенсоры могут использоваться, конечно, не только для выявления загрязнителей, но и в диагностике и промышленности.
Такие микроорганизмы-биосенсоры гораздо более стабильны и менее требовательны к условиям хранения, чем очищенные белки. Их получение требует меньших затрат, поскольку они не требуют сложных процедур очистки. Кроме того, они, как полноценные биологические системы, содержат сами по себе необходимые кофакторы, и их внутренняя среда - естественная для протекания биохимических превращений. Микроорганизмы используются в составе биосенсорных систем для решения различных задач, в частности – для выявления загрязнителей в окружающей среде.
Биодоступность - способность соединения взаимодействовать с живыми организмами нефизическим путём, адсорбироваться клетками и тканями организма. Она характеризует не только опасность загрязнителя, но и возможность его биоремедиации. Например, тяжёлые металлы в почве или на дне водоёмов часто становятся биодоступными только переходя в раствор. Однако и в растворённом виде, и в виде частиц тяжёлые металл, если верить биосенсорам, не является биодоступным на все 100%. Как правило, биодоступны 50 – 0,1% содержащегося в образце металла. С помощью биосенсоров можно оценить соотношение вещества в биодоступной форме и сравнить этот показатель с общей концентрацией, установленной химическими методами.
В основе работы биосенсора, как правило, лежат сигнальные и метаболические пути, которые уже существуют в природе. Однако, чтобы использовать эти возможности было проще, как правило, гены, кодирующие соответствующие продукты переносят в клетки кишечных палочек, или других устойчивых и простых в обращении микроорганизмов. Сигнал биосенсора может иметь различную природу. Это и изменение pH среды, то есть электрохимический сигнал, который можно определить электродами, и различные виды оптических сигналов – изменение цвета за счёт формирования цветного продукта, накопление флюоресцентных продуктов или биолюминесценция. Например, регулятор роста растений α-нафталин уксусной кислоты и пестицид линдан разрушаются с образованием кислоты.
Иммобилизация микроорганизмов, способных осуществлять ткие процессы на электроде позволяет создать электрохимический сенсор. Гидролиз фосфорорганического пестицида параоксона идёт с образованием жёлтого p-нитрофенола, и этот процесс можно детектировать по изменению цвета. Однако в ряде случаев не удаётся найти адекватную реакцию, которая могла бы дать легко детектируемый продукт или существенное изменение характеристик среды. В таких случаях применяются гены, продукты которых, репортерные белки, катализируют реакции, детектируемые по изменению цвета или люминесценции, или способны к флюоресценции. β-галактозидаза, например, может взаимодействовать с различными субстратами, образуя окрашенные, люминесцентные и электрохимические продукты. Множество описанных флюоресцентных белков, а также люциферазы и их субстраты, люциферины, которые превращают энергию гидролиза АТФ в люминесцентный сигнал, могут быть источником свечения, которое будет ответом биосенсора на стимул.
Одним из наиболее распространённых вариантов механизма работы микроорганизма-биосенсора, является пара «транскрипционный регулятор – промотор». Под промотор помещается ген того или иного репортерного белка и детектируется его синтез в ответ на сигнал. Такие сенсоры могут выявлять мишени, вызывающие ответ у микроорганизмов – наличие тяжёлых металлов, антибиотиков или токсинов в окружающей среде.
Как правило, для биосенсоров, действие которых основано на активации промотора в ответ на присутствие тяжёлых металлов, используются уже существующие промоторные последовательности. Это промоторы генов, продукты которых защищают микроорганизмы от воздействия тяжёлых металлов. Такие системы могут обеспечивать устойчивость к свинцу, ртути, кадмию, мышьяку, серебру, сурьме, токсичным даже в малой концентрации, и к металлам, которые опасны только в повышенных концентрациях – цинку, железу, никелю, меди, кобальту и хрому. Некоторые системы очень специфичны: гены isiAB Synechococcus sp, copBC Pseudomonas fluorescens и pbrR и chrA Cupriavidus metallidurans отвечают только на присутствие железа, меди, свинца и хрома соответственно.
У Escherichia coli, напротив, arsR отвечает на присутствие мышьяка, кадмия и сурьмы, cadC активируется кадмием, свинцом, сурьмой, цинком и оловом, а zntA - кадмием, хромом, ртутью, свинцом и цинком. Во всех вышеуказанных случаях активируются системы защиты, однако описана цианобактерия, у которой в ответ на присутствие некоторых потенциально опасных металлов активируются системы, обеспечивающие поступление необходимых ей металлов в клетку. Такая система была бы более чувствительной к низким концентрациям. Пара регулятор-промотор XylR и Pu, найденная в пути деградации ксилола Pseudomonas sp и может применяться для выявления ксилола, бензола и толуола, а пара DmpR и Po аналогичным образом может использоваться в биодетекторе фенолов.
Однако есть и другие механизмы работы биосенсоров. Чувство кворума управляется низкомолекулярными соединениями, которые распространяются на несколько микрон вокруг клетки, например ацил-гомосеринлактонами. Под контролем систем чувства кворума находятся продукция факторов вирулентности, формирование биоплёнок, биолюминесценция, состояние компетентности, споруляция и другие процессы. Когда E.coli, продуцирующая GFP в осциллирующих количествах, была выращена в микрофлюидных каналах под контролем системы чувства кворума, которая, в свою очередь, была помещена под промотор, активируемый в присутствии мышьяка, в присутствии мышьяка осцилляция флюоресценции учащалась.
Белки можно «заставить» присутствовать на поверхности клетки, присоединяя к генам последовательности, кодирующие сигнальные структуры, которые определят направление транспорта продукта. Инсектицид паратион и параксон будут разлагаться культурой бактерий в семь раз эффективнее, если фермент находится на поверхности клетки. Если разместить такие микроорганизми в системе, детектирующей электрохимические процессы, можно использовать их в качестве компонента биосенсора, и выявлять таким путём фосфорорганические пестициды.
Рецепторы, сопряжённые с G-белком – большое семейство мембранных рецепторов. Они взаимодействуют как низкомолекулярными соединениями, так и с белками и гликопротеинами. Сигнал от этих рецепторов передаётся к GTP-связывающим белкам (G-белкам) и активирует клеточный ответ. GPCR человека, связывающиеся с опиоидами, нейротрансмиттерами, гормонами и нуклеотидами могут успешно экспрессироваться и работать в дрожжах. Искусственно полученные мутантные формы могут повышать чувствительность системы в десятки раз. Активация ионных каналов, ведущая к изменению мембранного потенциала в ответ на присутствие лиганда – вариант для выявления ионов и молекул.
Такие биосенсоры могут позволить получить ответ в короткие сроки – не более нескольких часов, в том числе и вне лаборатории, за счёт устойчивости микроорганизмов и их нетребовательности к условиям хранения и перевозки. Получение мутантных рецепторов, повышающих чувствительность систем, создание новых генно-инженерных конструкций, которые позволят отвечать на сигнал точнее, поиск и использование существующих в природе рецепторов и регуляторов – всё это пути создания более быстрых и точных сенсоров. Такие биосенсоры могут использоваться, конечно, не только для выявления загрязнителей, но и в диагностике и промышленности.