Волшебные картины микрокосма

Электронная микроскопия дает ученым возможность заглянуть внутрь клетки, которую можно представить в виде Вселенной в миниатюре. И наши познания о ней также не имеют конца, как и познания о Космосе. Тем сильнее наше стремление заглянуть глубже и познать больше. С помощью современных оптических микроскопов ученые могут видеть только такие крупные компоненты клетки, как митохондрии и ядро. Но когда на помощь приходит сканирующая электронная и атомно-силовая микроскопия, то пытливому глазу исследователя становятся доступны объекты размером в несколько нанометров...

Слева: дрожжевая клетка с удаленным фрагментом клеточной оболочки. Видно округлое ядрои цитоплазматические структуры. Справа: дрожжевые клетки под световым микроскопом. Стрелками показаны почкующиеся дрожжи.

В настоящее время электронная микроскопия (ЭМ) нашла широкое применение в микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, медицинской генетике и иммунологии. Благодаря ЭМ раскрыта субмикроскопическая структура клеток, открыт ряд неизвестных ранее клеточных органелл, таких как лизосомы, рибосомы, эндоплазматический ретикулум, микротрубочки, цитоскелет и прочие структуры, специфичные для разных видов клеток. Электронная микроскопия позволила понять многие тонкие механизмы развития болезней, в том числе на ранних этапах их возникновения, еще до появления четкой клинической симптоматики.

Гипотетическая схема строения клеточного ядра

К сожалению, просвечивающая электронная микроскопия ограничена в своих возможностях по исследованию и диагностике поверхности клеточных структур, и лет пятнадцать назад вопрос о том, как заглянуть внутрь ядра и получить трехмерное изображение внутриядерных и околоядерных структур, был неразрешим. Дело в том, что тонкие срезы ткани, которые изучаются под микроскопами, являются двумерными срезами и не позволяют судить о трехмерной структуре клеточных компонентов. Трехмерное изображение можно получить после реконструкции сотен серийных срезов, но это длительный и трудоемкий процесс.

«Мембранная рапсодия».

Мембранные компоненты эндоплазматического ретикулума на поверхности ядра ооцита лягушки. Эндоплазматический ретикулум (ЭПР) – система пузырьков, цистерн и трубочек, связанных между собой в единое внутриклеточное пространство, отделенное от остальной части цитоплазмы замкнутой внутриклеточной мембраной. Эта сеть пронизывает все цитоплазматическое пространство клетки и состоит из двух типов ЭПР – шероховатого, покрытого рибосомами и гладкого, без рибосом. Главной функцией эндоплазматического ретикулума первого типа является биосинтез (с помощью рибосом), модификация и транспортировка белков. ЭПР второго типа обеспечивает синтез липидов и полисахаридов. Мембраны ЭПР тесно взаимодействуют с различными органеллами клетки, а также с ее плазматической мембраной и ядерной оболочкой, в формировании которой при делении и росте клеток они принимают активное участие.

«Синий спрут».

Мембранные компоненты эндоплазматического ретикулума на поверхности ядра, изолированного из ооцита лягушки. Мембранные компоненты ЭПР (цистерны, пузырьки, трубочки) принимают активное участие в сборке новых фрагментов ядерной оболочки растущих неделящихся ядер. Мембраны ЭПР сливаются с наружной мембраной ядра, затем часть мембран ЭПР перемещается на внутреннюю мембрану и сближается с наружными мембранами, формируя новый участок ядерной оболочки.

В настоящее время разработаны более прямые методы получения трехмерного изображения. Один из них состоит в изучении образца в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ), который обычно меньше и проще, чем просвечивающий электронный микроскоп.

Цитоплазматическая поверхность ядерной оболочки интерфазного ядра, выделенного из ранних эмбрионов дрозофилы. Видны ядерные поры и пузырьки эндоплазматического ретикулума. Справа внизу: Фрагмент содержимого ядра (нуклеоида) ооцита лягушки. Ядро выделили из ооцита, затем осторожно убрали ядерную оболочку и получили желеобразный шарик – нуклеоид, который сохраняет форму на короткое время, затем превращается в уплощенный сгусток. Можно различить сеть внутриядерных филаментов и сферические тельца.

Для получения изображения в просвечивающем электронном микроскопе используют электроны, проходящие через образец, а в сканирующем электронном микроскопе регистрируются электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью образца. Для изучения в СЭМ образец должен быть зафиксирован, высушен и покрыт тонкой пленкой тяжелого металла. Затем образец сканируется узким пучком электронов. Отраженные и рассеянные при облучении образца электроны попадают в детектор, анализирующий полученную информацию, которая затем преобразуется в увеличенное изображение на экране.

«Внутриядерные рельсы».

Актинсодержащие филаменты внутриядерного матрикса ооцита лягушки. После выделения ядра из ооцита лягушки осторожно стеклянной иголкой отвернули фрагмент ядерной оболочки и заглянули внутрь, сохранив контакты внутренней мембраны ядерной оболочки с внутриядерным содержимым. До сих пор идут споры о том, что обеспечивает распределение и организацию клеточных компонентов (хромосом, ядрышка, сферических телец, рибонуклеопротеидных (РНП) частиц) внутри ядра. Отметим, что в отличие от цитоплазмы все внутриядерные компоненты не имеют оболочек, тем не менее многие процессы внутри ядра – компартментализованы, т. е. происходят, например, только в ядрышке или в определенных сферических тельцах. А хромосомы вообще занимают строго определенные области внутри ядра – так называемые «хромосомные территории». Предполагается, что ведущую роль в этом процессе выполняют ядерная оболочка и внутриядерный матрикс.

«Неизвестная планета».

Сферическое тельце Кохала, содержащее белки для сплайсинга (удаление интронов из молекулы) РНК, подвешенное на внутриядерных актинсодержащих нитях.

Метод сканирующей электронной микроскопии обеспечивает значительную глубину фокусировки. Более того, поскольку масштабы рассеивания электронов определяются углом поверхности по отношению к сканирующему лучу, то на изображении возникают чередующиеся светлые и темные участки, создающие впечатление трехмерности. А с появлением высокоразрешающего сканирующего автоэмиссионного электронного микроскопа (Field Emission in Lenz, фирмы Hitachi) ученым удалось получить уникальные трехмерные снимки цитоплазматической и внутриядерной поверхности ядерной оболочки, изучить тонкое строение ядерных поровых комплексов и заглянуть внутрь ядра.

Контакт хроматина (окрашен зеленым) с актинсодержащими филаментами и тельцем Кахала.

Ядрышко, подвешенное на актинсодержащих нитях внутри ядра

В процессе транскрипции на ДНК, молекула мРНК сразу упаковывается с белками (их около двадцати, они закручивают нить мРНК и покрывают ее защитной оболочкой) в РНП фибриллу (нитку диаметром 10—20 нм), а затем в компактную РНП частицу (диаметром от 30 до 50 нм). Это с одной стороны защищает молекулу РНК от разрушения, а с другой обеспечивает ее эффективное перемещение внутри ядра. Внутреннее пространство ядра достаточно плотно заполнено различными структурами и молекулами. И в этом «столпотворении» мРНП частица должна переместиться к ядерной поре, заякориться на ней и транспортироваться через центральный канал поры в цитоплазму, где на ней должен начаться процесс трансляции – синтеза белка. РНК-связанные белки играют большую роль в транспорте мРНК. Как показали исследования, часть белков удаляется с РНП частицы, когда пора находится в баскет структуре, а некоторые белки перемещаются с мРНК в цитоплазму и участвуют в процессе трансляции. Удаление части белков приводит к тому, что РНП частица разворачивается в более узкую РНП фибриллу, что обеспечивает ей эффективный транспорт через центральный канал поры, диаметр которого при этом расширяется до 25 нанометров. Вверху: Три отдела неактивной ядерной поры на большом увеличении: внутриядерный, центральный и цитоплазматический компартменты (слева направо). В центре: активно функционирующая пора. Видно, как рибонуклеопротеидная фибрилла (РНП фибрилла) проходит через различные компартменты ядерной поры. Слева направо показано, как РНП частица сначала заякоревается на верхушке баскета внутриядерного компартмента и начинает разворачиваться в фибриллу, так как размер канала ядерной поры меньше размера частицы. Затем мы видим фибриллу (окрашено темнокрасным) в канале центрального компартмента поры. И, наконец, – фибриллу РНП, выходящую из поры в цитоплазму. Внизу: схематическое изображение того, что видно на верхних снимках – представлены три стадии прохождения РНП фибриллы через разные отделы ядерной поры. Представленные снимки демонстрируют высокую сложность организации ядерной поры – этой миниатюрной космической станции, находящейся в глубинах живой клетки.

Сборка ядерных поровых комплексов в участках сплавления пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной

Цепочка мелких пузырьков ЭПР, в сплавлении которых, возможно, принимает участие ретикулон 4, на цитоплазматической поверхности ядерной оболочки ооцита лягушки.

«Место встречи изменить нельзя».

Локализация белка ретикулона в участках слияния пузырьков эндоплазматического ретикулума. Белки ретикулоны обнаружены во всех эукариотах и являются интегральными мембранными белками, т. е. встроены в клеточные мембраны. Известны четыре гена, кодирующиХ ретикулоны 1, 2, 3 и 4. В 2006 г. американскими исследователями было установлено, что белок ретикулон 4 (NogoA в другой транскрипции) может изменять кривизну мембран ЭПР в условиях in vitro (в пробирке) и превращать его компоненты в микротрубочки. Мы впервые продемонстрировали в условиях in vivo, что этот белок локализуется в участках сплавления компонентов (пузырьков) ЭПР друг с другом, а также в участках сплавления компонентов ЭПР с наружной мембраной ядерной оболочки. Это предполагает важную роль ретикулона 4 в сборке новых фрагментов ядерной оболочки. Эти данные опубликованы нами в 2007 г. в J. Struct. Biol. Поскольку этот белок принимает участие в развитии болезни Альцгеймера (показано, что он ингибирует рост аксонов в нервных клетках), то исследование функций этого белка представляет большой научный интерес.

E. Kiseleva

Все представленные в этой публикации снимки получены с использованием высокоразрешающего сканирующего электронного микроскопа фирмы Hitachi, на котором работала автор в Институте раковых исследований им. Паттерсона, в г. Манчестер (Англия), в рамках проекта по исследованию структурной организации ядерной оболочки растущих неделящихся ядер, таких как ооциты амфибий и интерфазных ядер ранних эмбрионов дрозофилы.