Биологическая эволюция — общая форма существования живой материи. При детальном рассмотрении оказывается, что виды почти никогда не эволюционируют поодиночке. Обычно в этом принимают участие их экологические партнёры. Таким образом, изменение происходит в парах: паразит — хозяин, хищник — жертва. Эволюционное изменение одного вида неизбежно приводит к изменению другого. Более того, взаимную эволюцию, когда один вид совершенствует систему нападения, а другой вслед за ним — систему защиты (и наоборот), часто можно проследить на молекулярном уровне. И здесь наиболее действенной и элегантной оказалась система нападения с помощью ядов, содержащих в своём составе нейротоксины — вещества, воздействующие на нервную систему и мышцы жертвы.
Несмотря на детальную проработку теории эволюции профессионалами и многочисленные примеры, вошедшие в учебники и популярную литературу, воплощение эволюционного процесса зачастую настолько причудливо, что исследование изменений в живых организмах может быть интересно не только учёным-теоретикам. Известно, что у эволюции нет воли и цели: живые организмы меняются, чтобы оставить максимальное потомство, а не чтобы достигнуть абстрактного совершенства. Так, эволюционно прогрессивным признаком считается тот, который позволяет лучше приспособиться к окружающим условиям в данный момент, а не красота или сложность устройства сами по себе.
Например, антарктическая ледяная рыба утратила гены гемоглобина из-за того, что в условиях её обитания, при температурах близких к нулю и даже ниже нуля растворимость кислорода в воде достаточно высока, чтобы обеспечивать ткани этим газом просто за счёт диффузии и усиления кровотока. Можно сказать, что в этом случае рыба «экономит» на гемоглобине. Другие рыбы, которые живут в пещерах или обитают на очень больших глубинах, почти всегда за ненадобностью теряют зрение. Степень упрощения строения паразитических организмов вообще поражает воображение, причём в случае бактерий это приводит к кардинальному упрощению всего генетического аппарата: например, геном микоплазмы — бактерии, не имеющей клеточной стенки, содержит всего около 500 генов. А у Candidatus Carsonella ruddii — бактерии, живущей внутри клеток листоблошек, и вовсе 182 гена. И всё перечисленное — прогрессивные признаки, поскольку они позволили упомянутым организмам максимально пластично адаптироваться к обстановке, в которой обитают. Более известный (и более «благородный») пример — эволюция человека, где развитие пошло по пути усложнения нервной системы и способности к коммуникации, а также к становлению богатой культуры, современное состояние которой мы имеем удовольствие ежедневно наблюдать вокруг. Одновременно возросла роль полового отбора и образования семей, — и всё это тоже проделки эволюции.
Похожий эффект наблюдается и в процессе коэволюции (совместной эволюции) двух видов, связанных друг с другом. Изменение одного из видов неизбежно влечёт изменение другого для сохранения паритета или получения превосходства. Простейший пример — газели и гепарды. И тем и другим приходится бегать из поколения в поколение всё быстрее и быстрее: одним — чтобы остаться в живых, другим — чтобы утолить голод.
Подчёркивая параллель с «холодной войной», биологи ввели понятие эволюционной «гонки вооружений» (англ. evolutionary arms race), приписывая данному процессу роль важнейшей движущей силы эволюции. Более строго это понятие сформулировано в форме принципа Чёрной королевы, утверждающего, что в коэволюционных отношениях каждому из видов приходится «бежать со всех ног, чтобы только остаться на том же месте» (цитата из «Алисы в Зазеркалье», удачно передающая суть принципа). Прямое экспериментальное подтверждение принципа Чёрной королевы получено на микроскопических рачках дафниях и их паразитических бактериях: «воскресив» из донного ила несколько поколений тех и других, биологи показали, что самые опасные для дафний паразиты — современные им, тогда как прошлые и будущие популяции бактерий заражали рачков с меньшей эффективностью.
Одно из наиболее прогрессивных эволюционных приобретений высших позвоночных — развитая иммунная система, основанная на принципе комбинаторики и позволяющая противостоять практически любому чужеродному организму. Однако бактерии и вирусы не сдаются, им тоже есть что предъявить из своего арсенала. Хорошо известный пример — постоянно мутирующий вирус гриппа, к которому необходимо получать всё новые и новые вакцины. Другой, не менее поразительный, пример — явление «смены фаз» у бактерий, заключающееся в случайном изменении фенотипа с высокой частотой, намного превышающей частоту обычных мутаций. Так, сальмонеллы используют этот приём для замены белка флагеллина, из которого построены бактериальные жгутики и который служит сигналом для запуска иммунологических реакций. Только у хозяина разовьётся иммунный ответ, как сальмонелла меняет тип флагеллина и ускользает!
Пожалуй, самым эффективным средством как нападения, так и защиты служат яды, которые в процессе эволюции научились вырабатывать разнообразнейшие животные: многие кишечнополостные, членистоногие, моллюски, хордовые и другие. Присутствующие в ядах молекулы называют токсинами, а в том частном (но распространённом) случае, когда мишенью их действия служит нервная система и/или мышцы, — нейротоксинами.
Состав яда животных различен: если, допустим, в яде пчелы присутствуют всего два основных компонента — мембрано-активный пептид мелиттин и гидролизующий липиды фермент фосфолипаза A2, то в яде пауков, скорпионов, морских анемон и конусов, а также змей содержатся десятки, а иногда сотни или даже тысячи компонентов различной химической природы. Наблюдаемое в ядах разнообразие компонентов одного структурного типа сегодня принято описывать термином «эволюционно отредактированная комбинаторная библиотека». Молекулы, составляющие библиотеку, обладают различной эффективностью и специфичностью в отношении разных рецепторов, а результирующая смесь токсинов эффективна в отношении широкого круга мишеней.
Сигналы передаются по нервной сети благодаря потенциалу действия, распространяющемуся вдоль нейрона. Этот процесс начинается с активации потенциал-чувствительных натриевых каналов. Канал состоит из четырёх похожих фрагментов-повторов (а), обозначенных I–IV. Каждый фрагмент содержит шесть трансмембранных α-спиралей. Четыре спирали (S1–S4) формируют потенциал-чувствительный домен. Общий для канала поровый домен образован восемью спиралями, по две (S5 и S6) от каждого повтора. Четвёртая спираль в каждом потенциал-чувствительном домене положительно заряжена. Она выполняет роль сенсора потенциала.
На рисунке показаны места, с которыми связываются α- и β-токсины скорпионов. В пространстве повторы структуры потенциал-чувствительного натриевого канала располагаются вокруг общей оси (б). Центральный поровый домен канала образован восемью спиралями, а потенциал-чувствительные домены расположены на периферии. Участок между спиралями S5 и S6 содержит «селективный фильтр» (в), обеспечивающий избирательное пропускание ионов Na+
Эволюционное преимущество богатого арсенала — способность «следовать» за жертвой: если мишень действия основного компонента яда начнёт ускользать (например, рецептор мутирует), в яде с большой вероятностью обнаружится слабо представленный, но более активный по отношению к новой форме рецептора токсин и теперь уже ему суждено будет стать основой «вооружения» у будущих поколений ядовитых хищников.
Каждый ПЧНК состоит из очень длинной полипептидной цепи (около двух тысяч остатков аминокислот), которая представлена четырьмя похожими фрагментами — повторами цепи. При этом в пространстве канал составлен из пяти частей (или доменов). В образовании единственного пóрового домена участвуют все повторы полипептидной цепи, в его центре формируется селективная для ионов Na+ пора. Четыре — по одному от каждого повтора — потенциал-чувствительных домена расположены вокруг центрального пóрового домена. Функция потенциал-чувствительного домена — реагировать на изменение мембранного потенциала и передавать команду на открытие поры.
ПЧНК — ключевой компонент передачи нервных импульсов, а значит, и работы нервной системы вообще. Очевидно, именно этим обусловлено существование огромного числа токсинов, связывающихся с ПЧНК и так или иначе нарушающих их работу. В свою очередь нарушение работы ПЧНК приводит к параличу, судорогам, а смерть наступает, как правило, от остановки дыхания. Например, тетродотоксин, содержащийся в знаменитом японском деликатесе — рыбе фугу и в некоторых других животных, блокирует пору натриевого канала подобно пробке. Интересно, что некоторые тритоны используют тетродотоксин для защиты от хищников, а охотящиеся на этих тритонов змеи приобретают устойчивость в результате мутации генов ПЧНК. К блокаторам ПЧНК относятся небольшие пептиды μ-конотоксины, являющиеся оружием морских моллюсков-конусов. Местные анестетики, такие как новокаин и лидокаин, тоже являются блокаторами ПЧНК: их местное применение приводит к блокаде чувствительных нейронов.
Но не все токсины блокируют канал: есть и такие, которые его активируют, то есть увеличивают время, когда канал находится в открытом состоянии. Пример таких молекул — батрахотоксин, содержащийся в секрете кожных желёз некоторых южноамериканских лягушек-листолазов. Распространённые инсектициды пиретроиды также относятся к активаторам ПЧНК.
В яде скорпионов есть α- и β-токсины. Они представляют собой небольшие белки (~60—70 аминокислотных остатков), в структуре которых присутствует β-лист из трёх тяжей и короткая α-спираль, скреплённые четырьмя дисульфидными связями. Хотя и те и другие токсины, по сути, активируют канал, делают они это по-разному: α-токсины мешают каналу закрыться, а β-токсины помогают ему открыться. Соответственно и места взаимодействия с ПЧНК у этих токсинов разные: и те и другие связываются с потенциал-чувствительным доменом, но для α-токсинов это домен IV, а для β-токсинов — домен II.
Остановимся подробнее на α-токсинах и на их «взаимоотношениях» с ПЧНК. Дело в том, что в яде скорпионов присутствуют молекулы, обладающие токсическим действием по отношению к насекомым или млекопитающим (назовём соответствующие α-токсины инсектотоксинами и млекотоксинами). И те и другие связываются с потенциал-чувствительным доменом IV, но только у разных каналов. У насекомых это свой канал, называемый Para, а у млекопитающих есть целых девять разновидностей каналов, обозначаемых Nav1.1—1.9. Разные ПЧНК млекопитающих выполняют разные функции. Например, Nav1.2 характерен для центральной нервной системы, Nav1.4 — для скелетной мускулатуры, Nav1.5 — для сердца. А дальше в ход идёт упомянутая «комбинаторная библиотека» яда скорпионов, в которой может найтись молекула, активная по отношению к выбранной мишени. Если это происходит, «владелец» такого яда получает эволюционное преимущество по сравнению с другими и та часть его генома, которая отвечает за состав «ядовитой библиотеки», широко распространяется в будущих поколениях скорпионов.
Присутствующие в яде скорпионов нейротоксины отличаются разнообразием: некоторые из них могут быть направлены исключительно на каналы насекомых (инсектотоксины), тогда как другие действуют на каналы млекопитающих (млекотоксины). Есть также молекулы, действующие сразу и на те, и на другие ПЧНК. Что лежит в основе молекулярной эволюции этих токсинов и позволяет им угнаться сразу за множеством ускользающих мишеней? Попробуем ответить на этот вопрос.
Компьютерный анализ структуры и динамики позволил выявить характерные особенности млеко- и инсектотоксинов и предсказать активность «сиротского» токсина с неизвестной селективностью. Эта часть работы сделана в лаборатории моделирования биомолекулярных систем.
Затем предсказания проверили в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов: был синтезирован «сиротский» токсин и исследована его специфичность.
Компьютерное моделирование основывалось на методе молекулярной динамики. Установлено, что молекулы α-токсинов, несмотря на свой небольшой размер и жёсткую структуру, состоят из двух динамических модулей. Анализ характерных движений показал, что один из этих модулей достаточно «жёсткий», а другой — довольно «пластичный». Более того, движения «пластичного» модуля различаются у млеко- и инсектотоксинов.
Идентифицированные с помощью молекулярной динамики части молекул получили название «сердцевинный модуль» и «модуль специфичности». Сердцевинный модуль α-токсинов оказывается эволюционно консервативным (очень сходно устроенным у инсекто- и млекотоксинов), а модуль специфичности — вариабельным, соответствующим конкретной мишени действия. Сердцевинный модуль, таким образом, отвечает за распознавание ПЧНК вообще, а быстро изменяющийся в эволюции модуль специфичности позволяет токсину «настраиваться» на конкретный тип канала.
Было также обнаружено, что модуль специфичности млекотоксинов существенно более гидрофильный («любящий воду», предпочитающий водные растворы), чем у инсектотоксинов. Эта особенность, предположительно, отражает структурные детерминанты, позволяющие токсинам выборочно распознавать свои мишени. Что интересно, анализ свойств ПЧНК показал ту же тенденцию для внеклеточной части S5–S6 повтора I: у каналов млекопитающих эти области более гидрофильны, чем у каналов насекомых. Сопоставление результатов анализа с накопленными биохимическими данными позволило предложить любопытный характер связывания α-токсинов с ПЧНК. Сердцевинный модуль, по-видимому, взаимодействует с потенциал-чувствительным доменом IV, в то время как модуль специфичности связывается с петлёй S5–S6 повтора I. Данные области в структуре ПЧНК сближены, что также было показано в независимых экспериментах. Идея соответствия модульной организации токсинов доменной структуре каналов имеет интересный эволюционный смысл, позволяющий нам разглядеть «гонку вооружений» в противостоянии ядовитых животных и их жертв. Модульная структура, предположительно, позволяет токсинам гибко адаптироваться к изменяющейся мишени.
Компьютерный анализ может быть использован для предсказания активности токсинов с неизученными свойствами. В частности, для токсина M9 из яда среднеазиатского скорпиона Mesobuthus eupeus, ставшего первым нейротоксином из скорпионьего яда, для которого была установлена пространственная структура (кстати, это тоже сделано в ИБХ), предсказана активность в отношении каналов как млекопитающих, так и насекомых. Биоинженерный синтез и тестирование активности этого токсина на рекомбинантных ПЧНК подтвердили высказанное предположение. Результаты представленной работы опубликованы в журнале «The Journal of Biological Chemistry». Эволюционное обособление модулей α-токсинов, похоже, вызвано требованиями «гонки вооружений» — необходимостью оперативно адаптироваться вслед за изменяющимися условиями среды: появлением новых мишеней и изменением старых. Вряд ли этот подход универсален, но в данном случае он позволил с новой стороны взглянуть на взаимосвязь структура — функция для биологически активных пептидов.
Придание нейротоксинам желаемой селективности и видоспецифичности позволит, например, создать инсектицид нового поколения. Биоинженерно изготовленный или даже внедрённый в геном растений инсектотоксин будет эффективно бороться с насекомыми-вредителями. А можно представить себе возможность создания идеально селективного инсектотоксина, действующего на вредителей и нетоксичного для полезных насекомых (например, пчёл).
Наконец, идеально селективные нейротоксины — уже не яды, а точно настраиваемые нейрорегуляторы — нашли бы применение в молекулярной медицине для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией ионных каналов и называемых каналопатиями. Среди них — различные неврологические и психические расстройства, а также патологии скелетной и сердечной мускулатуры.
 |
|
Несмотря на детальную проработку теории эволюции профессионалами и многочисленные примеры, вошедшие в учебники и популярную литературу, воплощение эволюционного процесса зачастую настолько причудливо, что исследование изменений в живых организмах может быть интересно не только учёным-теоретикам. Известно, что у эволюции нет воли и цели: живые организмы меняются, чтобы оставить максимальное потомство, а не чтобы достигнуть абстрактного совершенства. Так, эволюционно прогрессивным признаком считается тот, который позволяет лучше приспособиться к окружающим условиям в данный момент, а не красота или сложность устройства сами по себе.
Например, антарктическая ледяная рыба утратила гены гемоглобина из-за того, что в условиях её обитания, при температурах близких к нулю и даже ниже нуля растворимость кислорода в воде достаточно высока, чтобы обеспечивать ткани этим газом просто за счёт диффузии и усиления кровотока. Можно сказать, что в этом случае рыба «экономит» на гемоглобине. Другие рыбы, которые живут в пещерах или обитают на очень больших глубинах, почти всегда за ненадобностью теряют зрение. Степень упрощения строения паразитических организмов вообще поражает воображение, причём в случае бактерий это приводит к кардинальному упрощению всего генетического аппарата: например, геном микоплазмы — бактерии, не имеющей клеточной стенки, содержит всего около 500 генов. А у Candidatus Carsonella ruddii — бактерии, живущей внутри клеток листоблошек, и вовсе 182 гена. И всё перечисленное — прогрессивные признаки, поскольку они позволили упомянутым организмам максимально пластично адаптироваться к обстановке, в которой обитают. Более известный (и более «благородный») пример — эволюция человека, где развитие пошло по пути усложнения нервной системы и способности к коммуникации, а также к становлению богатой культуры, современное состояние которой мы имеем удовольствие ежедневно наблюдать вокруг. Одновременно возросла роль полового отбора и образования семей, — и всё это тоже проделки эволюции.
Уроки «холодной войны». Принцип Чёрной королевы
Вторая половина XX века кроме замечательных открытий в молекулярной биологии была ознаменована «холодной войной» — глобальной конфронтацией между социалистическим и капиталистическим строем. Это противостояние породило эффект «гонки вооружений» — процесс борьбы за военное превосходство с положительной обратной связью, вызвавший гипертрофию военно-промышленных комплексов СССР и США.Похожий эффект наблюдается и в процессе коэволюции (совместной эволюции) двух видов, связанных друг с другом. Изменение одного из видов неизбежно влечёт изменение другого для сохранения паритета или получения превосходства. Простейший пример — газели и гепарды. И тем и другим приходится бегать из поколения в поколение всё быстрее и быстрее: одним — чтобы остаться в живых, другим — чтобы утолить голод.
Подчёркивая параллель с «холодной войной», биологи ввели понятие эволюционной «гонки вооружений» (англ. evolutionary arms race), приписывая данному процессу роль важнейшей движущей силы эволюции. Более строго это понятие сформулировано в форме принципа Чёрной королевы, утверждающего, что в коэволюционных отношениях каждому из видов приходится «бежать со всех ног, чтобы только остаться на том же месте» (цитата из «Алисы в Зазеркалье», удачно передающая суть принципа). Прямое экспериментальное подтверждение принципа Чёрной королевы получено на микроскопических рачках дафниях и их паразитических бактериях: «воскресив» из донного ила несколько поколений тех и других, биологи показали, что самые опасные для дафний паразиты — современные им, тогда как прошлые и будущие популяции бактерий заражали рачков с меньшей эффективностью.
Око за око, ген за ген
Хороший пример эволюционной «гонки вооружений» — растения с их паразитами. Во многих случаях наблюдается строгое соответствие системы устойчивости растения системе вирулентности (заразности) его паразита. Более того, это соответствие сводится всего лишь к двум генам: гену растения, позволяющему противостоять заражению (гену резистентности R), и гену паразита, необходимому для инфекции (гену авирулентности Avr). Такие межвидовые отношения получили название «ген за ген» (англ. gene-for-gene). Растения, содержащие ген R, оказываются устойчивыми по отношению к паразитам с соответствующим геном Avr. Как правило, гены резистентности растений кодируют белки-рецепторы, детектирующие появление паразита. Теперь паразит стремится изменить свой Avr-ген так, чтобы ускользнуть от узнавания рецептором растения. И наоборот, растение изменяет свой R-ген, чтобы по-прежнему детектировать заражение.Одно из наиболее прогрессивных эволюционных приобретений высших позвоночных — развитая иммунная система, основанная на принципе комбинаторики и позволяющая противостоять практически любому чужеродному организму. Однако бактерии и вирусы не сдаются, им тоже есть что предъявить из своего арсенала. Хорошо известный пример — постоянно мутирующий вирус гриппа, к которому необходимо получать всё новые и новые вакцины. Другой, не менее поразительный, пример — явление «смены фаз» у бактерий, заключающееся в случайном изменении фенотипа с высокой частотой, намного превышающей частоту обычных мутаций. Так, сальмонеллы используют этот приём для замены белка флагеллина, из которого построены бактериальные жгутики и который служит сигналом для запуска иммунологических реакций. Только у хозяина разовьётся иммунный ответ, как сальмонелла меняет тип флагеллина и ускользает!
Ядовитый арсена
Пожалуй, самым эффективным средством как нападения, так и защиты служат яды, которые в процессе эволюции научились вырабатывать разнообразнейшие животные: многие кишечнополостные, членистоногие, моллюски, хордовые и другие. Присутствующие в ядах молекулы называют токсинами, а в том частном (но распространённом) случае, когда мишенью их действия служит нервная система и/или мышцы, — нейротоксинами.
Состав яда животных различен: если, допустим, в яде пчелы присутствуют всего два основных компонента — мембрано-активный пептид мелиттин и гидролизующий липиды фермент фосфолипаза A2, то в яде пауков, скорпионов, морских анемон и конусов, а также змей содержатся десятки, а иногда сотни или даже тысячи компонентов различной химической природы. Наблюдаемое в ядах разнообразие компонентов одного структурного типа сегодня принято описывать термином «эволюционно отредактированная комбинаторная библиотека». Молекулы, составляющие библиотеку, обладают различной эффективностью и специфичностью в отношении разных рецепторов, а результирующая смесь токсинов эффективна в отношении широкого круга мишеней.
 |
Передача сигналов |
Сигналы передаются по нервной сети благодаря потенциалу действия, распространяющемуся вдоль нейрона. Этот процесс начинается с активации потенциал-чувствительных натриевых каналов. Канал состоит из четырёх похожих фрагментов-повторов (а), обозначенных I–IV. Каждый фрагмент содержит шесть трансмембранных α-спиралей. Четыре спирали (S1–S4) формируют потенциал-чувствительный домен. Общий для канала поровый домен образован восемью спиралями, по две (S5 и S6) от каждого повтора. Четвёртая спираль в каждом потенциал-чувствительном домене положительно заряжена. Она выполняет роль сенсора потенциала.
На рисунке показаны места, с которыми связываются α- и β-токсины скорпионов. В пространстве повторы структуры потенциал-чувствительного натриевого канала располагаются вокруг общей оси (б). Центральный поровый домен канала образован восемью спиралями, а потенциал-чувствительные домены расположены на периферии. Участок между спиралями S5 и S6 содержит «селективный фильтр» (в), обеспечивающий избирательное пропускание ионов Na+
Эволюционное преимущество богатого арсенала — способность «следовать» за жертвой: если мишень действия основного компонента яда начнёт ускользать (например, рецептор мутирует), в яде с большой вероятностью обнаружится слабо представленный, но более активный по отношению к новой форме рецептора токсин и теперь уже ему суждено будет стать основой «вооружения» у будущих поколений ядовитых хищников.
 |
| Ядовитые животные — источники «классических» нейротоксинов. Тетродотоксин из рыбы фугу блокирует пору потенциал-чувствительного натриевого канала, связываясь с внеклеточной стороны. |
«Всенепременнейше захватите телеграф!»
Как уже было сказано, частой мишенью действия ядов является нервная система, а поэтому основа арсенала многих ядовитых гадов — нейротоксины. Связано это, по-видимому, с тем, что нарушить работу сложной системы проще всего, уничтожив коммуникацию, что было отмечено ещё в работах Ленина, рекомендовавшего в случае захвата власти в первую очередь взять под контроль телефон, телеграф и железнодорожные станции. «Телеграф» нашего организма — нервная сеть, передача сообщений в которой основана на феномене потенциала действия, распространяющегося вдоль мембран нейронов. В состоянии покоя поддерживается определённая разница концентраций ионов (Na+, K+, Ca2+, Cl−) внутри нейронов и снаружи и формируется потенциал покоя. Рабочими элементами потенциала действия служат ионные каналы — мембранные белки, пропускающие те или иные ионы по команде. В частности, начинается потенциал действия с активации потенциал-чувствительных натриевых каналов (ПЧНК), открывающихся в ответ на уменьшение трансмембранной разности потенциалов (деполяризацию). Интересно, что появление таких каналов в эволюции животных тесно связано с дифференцировкой тканей и обособлением нервной системы. О них и поговорим подробнее, оставив другие каналы за рамками статьи.Каждый ПЧНК состоит из очень длинной полипептидной цепи (около двух тысяч остатков аминокислот), которая представлена четырьмя похожими фрагментами — повторами цепи. При этом в пространстве канал составлен из пяти частей (или доменов). В образовании единственного пóрового домена участвуют все повторы полипептидной цепи, в его центре формируется селективная для ионов Na+ пора. Четыре — по одному от каждого повтора — потенциал-чувствительных домена расположены вокруг центрального пóрового домена. Функция потенциал-чувствительного домена — реагировать на изменение мембранного потенциала и передавать команду на открытие поры.
ПЧНК — ключевой компонент передачи нервных импульсов, а значит, и работы нервной системы вообще. Очевидно, именно этим обусловлено существование огромного числа токсинов, связывающихся с ПЧНК и так или иначе нарушающих их работу. В свою очередь нарушение работы ПЧНК приводит к параличу, судорогам, а смерть наступает, как правило, от остановки дыхания. Например, тетродотоксин, содержащийся в знаменитом японском деликатесе — рыбе фугу и в некоторых других животных, блокирует пору натриевого канала подобно пробке. Интересно, что некоторые тритоны используют тетродотоксин для защиты от хищников, а охотящиеся на этих тритонов змеи приобретают устойчивость в результате мутации генов ПЧНК. К блокаторам ПЧНК относятся небольшие пептиды μ-конотоксины, являющиеся оружием морских моллюсков-конусов. Местные анестетики, такие как новокаин и лидокаин, тоже являются блокаторами ПЧНК: их местное применение приводит к блокаде чувствительных нейронов.
Но не все токсины блокируют канал: есть и такие, которые его активируют, то есть увеличивают время, когда канал находится в открытом состоянии. Пример таких молекул — батрахотоксин, содержащийся в секрете кожных желёз некоторых южноамериканских лягушек-листолазов. Распространённые инсектициды пиретроиды также относятся к активаторам ПЧНК.
В яде скорпионов есть α- и β-токсины. Они представляют собой небольшие белки (~60—70 аминокислотных остатков), в структуре которых присутствует β-лист из трёх тяжей и короткая α-спираль, скреплённые четырьмя дисульфидными связями. Хотя и те и другие токсины, по сути, активируют канал, делают они это по-разному: α-токсины мешают каналу закрыться, а β-токсины помогают ему открыться. Соответственно и места взаимодействия с ПЧНК у этих токсинов разные: и те и другие связываются с потенциал-чувствительным доменом, но для α-токсинов это домен IV, а для β-токсинов — домен II.
 |
| У скорпионов есть α-токсины — небольшие белки, составленные из β-листа и α-спирали, скреплённых дисульфидными связями. |
Остановимся подробнее на α-токсинах и на их «взаимоотношениях» с ПЧНК. Дело в том, что в яде скорпионов присутствуют молекулы, обладающие токсическим действием по отношению к насекомым или млекопитающим (назовём соответствующие α-токсины инсектотоксинами и млекотоксинами). И те и другие связываются с потенциал-чувствительным доменом IV, но только у разных каналов. У насекомых это свой канал, называемый Para, а у млекопитающих есть целых девять разновидностей каналов, обозначаемых Nav1.1—1.9. Разные ПЧНК млекопитающих выполняют разные функции. Например, Nav1.2 характерен для центральной нервной системы, Nav1.4 — для скелетной мускулатуры, Nav1.5 — для сердца. А дальше в ход идёт упомянутая «комбинаторная библиотека» яда скорпионов, в которой может найтись молекула, активная по отношению к выбранной мишени. Если это происходит, «владелец» такого яда получает эволюционное преимущество по сравнению с другими и та часть его генома, которая отвечает за состав «ядовитой библиотеки», широко распространяется в будущих поколениях скорпионов.
Присутствующие в яде скорпионов нейротоксины отличаются разнообразием: некоторые из них могут быть направлены исключительно на каналы насекомых (инсектотоксины), тогда как другие действуют на каналы млекопитающих (млекотоксины). Есть также молекулы, действующие сразу и на те, и на другие ПЧНК. Что лежит в основе молекулярной эволюции этих токсинов и позволяет им угнаться сразу за множеством ускользающих мишеней? Попробуем ответить на этот вопрос.
Компьютерный анализ
выявляет молекулярную «гонку вооружений»
Компьютерный анализ структуры и динамики позволил выявить характерные особенности млеко- и инсектотоксинов и предсказать активность «сиротского» токсина с неизвестной селективностью. Эта часть работы сделана в лаборатории моделирования биомолекулярных систем.
Затем предсказания проверили в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов: был синтезирован «сиротский» токсин и исследована его специфичность.
Компьютерное моделирование основывалось на методе молекулярной динамики. Установлено, что молекулы α-токсинов, несмотря на свой небольшой размер и жёсткую структуру, состоят из двух динамических модулей. Анализ характерных движений показал, что один из этих модулей достаточно «жёсткий», а другой — довольно «пластичный». Более того, движения «пластичного» модуля различаются у млеко- и инсектотоксинов.
Идентифицированные с помощью молекулярной динамики части молекул получили название «сердцевинный модуль» и «модуль специфичности». Сердцевинный модуль α-токсинов оказывается эволюционно консервативным (очень сходно устроенным у инсекто- и млекотоксинов), а модуль специфичности — вариабельным, соответствующим конкретной мишени действия. Сердцевинный модуль, таким образом, отвечает за распознавание ПЧНК вообще, а быстро изменяющийся в эволюции модуль специфичности позволяет токсину «настраиваться» на конкретный тип канала.
Было также обнаружено, что модуль специфичности млекотоксинов существенно более гидрофильный («любящий воду», предпочитающий водные растворы), чем у инсектотоксинов. Эта особенность, предположительно, отражает структурные детерминанты, позволяющие токсинам выборочно распознавать свои мишени. Что интересно, анализ свойств ПЧНК показал ту же тенденцию для внеклеточной части S5–S6 повтора I: у каналов млекопитающих эти области более гидрофильны, чем у каналов насекомых. Сопоставление результатов анализа с накопленными биохимическими данными позволило предложить любопытный характер связывания α-токсинов с ПЧНК. Сердцевинный модуль, по-видимому, взаимодействует с потенциал-чувствительным доменом IV, в то время как модуль специфичности связывается с петлёй S5–S6 повтора I. Данные области в структуре ПЧНК сближены, что также было показано в независимых экспериментах. Идея соответствия модульной организации токсинов доменной структуре каналов имеет интересный эволюционный смысл, позволяющий нам разглядеть «гонку вооружений» в противостоянии ядовитых животных и их жертв. Модульная структура, предположительно, позволяет токсинам гибко адаптироваться к изменяющейся мишени.
Компьютерный анализ может быть использован для предсказания активности токсинов с неизученными свойствами. В частности, для токсина M9 из яда среднеазиатского скорпиона Mesobuthus eupeus, ставшего первым нейротоксином из скорпионьего яда, для которого была установлена пространственная структура (кстати, это тоже сделано в ИБХ), предсказана активность в отношении каналов как млекопитающих, так и насекомых. Биоинженерный синтез и тестирование активности этого токсина на рекомбинантных ПЧНК подтвердили высказанное предположение. Результаты представленной работы опубликованы в журнале «The Journal of Biological Chemistry». Эволюционное обособление модулей α-токсинов, похоже, вызвано требованиями «гонки вооружений» — необходимостью оперативно адаптироваться вслед за изменяющимися условиями среды: появлением новых мишеней и изменением старых. Вряд ли этот подход универсален, но в данном случае он позволил с новой стороны взглянуть на взаимосвязь структура — функция для биологически активных пептидов.
Биоинженерия и нейробиология
Изучение молекулярных основ эволюционной «гонки вооружений» имеет не только фундаментальное значение. Например, заново созданные «дизайнерские» молекулы — аналоги нейротоксинов с заданной исследователями активностью — станут идеальными инструментами исследования нервной системы. Такие молекулы дадут возможность прицельно регулировать работу ионных каналов и модифицировать нервный ответ желаемым образом.Придание нейротоксинам желаемой селективности и видоспецифичности позволит, например, создать инсектицид нового поколения. Биоинженерно изготовленный или даже внедрённый в геном растений инсектотоксин будет эффективно бороться с насекомыми-вредителями. А можно представить себе возможность создания идеально селективного инсектотоксина, действующего на вредителей и нетоксичного для полезных насекомых (например, пчёл).
Наконец, идеально селективные нейротоксины — уже не яды, а точно настраиваемые нейрорегуляторы — нашли бы применение в молекулярной медицине для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией ионных каналов и называемых каналопатиями. Среди них — различные неврологические и психические расстройства, а также патологии скелетной и сердечной мускулатуры.
Anton Chugunov, Alexander Vasilevsky